靶向 siRNA对人直肠癌 Colo320细胞的抑制作用

 

黄 浩^{1, 2}, 关江锋², 余南才², 刘 倩², 易艳东², 马 威² ( 1. 华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系, 武汉 430030; 2. 武汉市第一医院中心实验室, 武汉 430022)

 

[ 摘   要 ]  目的: 利用小分子干扰 RNA ( siRNA )技术抑制人直肠癌 Co lo320细胞 c-my 基因的表达, 探讨 c-my c基因在人直肠

 

癌  Co lo320细胞中的作用。方法 : 设计人直肠癌 Co lo320细胞基因特异性小分子干扰 RNA, 用体外转录方法合成人直肠癌 Co lo320细胞的小分子干扰 RNA 并转染该细胞, 培养 48~ 96 h后, 收集细胞 RNA, 应用实时荧光定量 PCR 方法检测转染细胞中 c-my c基因 mRNA 水平变化, W estern blotting 检测 c-myc表达的蛋白, 四甲基偶氮唑蓝 ( M TT ) 法和集落形成试验检测细胞增殖活性。结果: 转染 siRNA 后, 与对照组相比, 实验组 pG ensil-c-myc-1、2、3、4的 c-my c基因 mRNA 水平明显降低, c-m yc的蛋

 

白表达也明显降低。M TT 法和集落形成试验检测表明, 实验组的细胞增殖速率明显低于对照组。结论: 在人直肠癌 Co lo320 细胞中存在 RNA 干扰的机制, 特异性 siRNA 能够有效地抑制 c-my c基因的表达, 从而抑制 Co lo320 细胞的增殖。

 

[ 关键词 ]  小分子干扰 RNA;  人直肠癌;  c-my c基因

 

[ 中图分类号 ]    R 37                [文献标识码 ]      A

 

 

Inhibition of c-myc expression in human rectal cancer cell line Colo320 by siR-NA technique

 

HUANG H ao1, 2,	GUAN Jiang-feng2, YU N an-cai 2,	LIU Q ian2, Y I Yan-dong2, MA W ei2 ( 1. D epartm en t of
Pathogen ic B iology,  Tongji M edical College,  H uazhong Un iversity  of Science			and T echnology,	Wuhan
430030,  Ch ina;	2. Cen ter of Experim entalM ed icine,	the F irstH osp ital ofW uhan,	W uhan 430030,	Ch ina)
[Abstract]  Objective: T o inhibit c-myc gene expression		in human rectal cancer cell line Colo320 by small interfering
RNA techn ique,	so as to assess the ro le of c-myc in Co lo320 cells. M ethods:  The c-myc gene spec ific siRNA w as de-

 

signed and prepared by in vitro transcription. T he prepared c-myc siRNA w as transfected into Colo320 cells. A fter cultured

 

for 48-96 hours,  the cellswere harvested.		c-myc mRNA and protein levelw asm onitored by fluorescence real tmi e reverse
transcription-polym erase chain reaction,		c-myc protein expression w as detected byW estern blotting,  and the cell prolifer-
ation activities were assayed by tetrazolium brom ide (MTT )  co lormi etry and clone test.  Resu lts:  Compared w ith contro l
group,	themRNA o f pGensi-lc-m yc-1,  2,	3,  and 4 in Colo320 ce lls was obv iously decreased in c-myc siRNA transfected
cells.	C-myc protein expression was also	decreased obv iously. M TT assay and clone test show ed that c-myc siRNA appar-

 

ently slow ed down the proliferation of Co lo320 cells.  Conclusion: O ur results suggest that RNA interference ex ists in Co-

 

lo320 cell line;  c-myc siRNA can specifically inhibit the expression o f c-myc gene in Colo320 cells,   subsequently inh ibits

 

the proliferation o fColo320 cells.

 

[K ey words]      sm all interfering RNA; hum an rectal cancer;     c-myc gene

 

[ Chin J Cancer B iother, 2006,  13( 5):    367-370]

 

原癌基因 c-myc的蛋白产物是一种 DNA 磷酸化蛋白质, 是调节细胞生长分化的重要转录激活因子。许多研究表明, c-my c基因表达失控在肿瘤发生中起关键作用 ^{[ 1-2]} 。已经证实人直肠癌 Colo320 细胞存在 c-myc 基因高表达的情况^{[ 3]} 。RNA 干扰 ( RNA interference, RNA i)能特异性抑制基因表达, 是一种转录后基因表达调控机制, 目前已被广泛应用于功能基因组和基因治疗的研究。本研究采用体外合成的小分子 RNA, 干

 

 

扰抑制人直肠癌 Colo320细胞中 c-myc 内源性的表达,探讨 c-myc基因对人直肠癌 Colo320细胞的调节作用。

 

 

 

[ 基金项目 ]   湖北省技攻关计划项目 ( 编号 2006AA301B66- 3)

 

[ 作者简介 ] 黄浩 ( 1972-), 男, 武汉人, 主治医师, 博士, 主要从事病原生物学与肿瘤分子生物学方面研究

 

[ 通讯作者 ]   黄 浩,  E-m a i:l  whhuanghao10@ yahoo. com. cn

_{# 368#}                                                                    中国肿瘤生物治疗杂志                                                                         第 13卷

 

 

1     材料与方法

 

1.  1  材料

 

人直肠癌细胞株 Co lo320 购置于武汉大学生命科学院, BamHⅠ, H in dⅢ购置凌飞生物有限公司, SYBR

 

G  reen荧光染料试剂盒购置晶美生物有限公司, 梭华 - So fast^TM /DNA 试剂盒购置武汉大风生物有限公司。

 

1.  2  细胞培养

 

人直肠癌细胞株 Colo320培养于含 10% 小牛血清的 DM EM 培养液中, 37e 、5% 的 CO₂ 条件下培养, 013% 的胰酶消化和传代。

 

1.  3  siRNA 合成和真核表达载体的构建

 

根据 c-myc基因序列 (G enBank NO. K 002467) siR-NA 设计规则设计 4 对 siRNA, 设计基因靶点分别于

 

c-myc基因的第 600、720、1 734、1 762位点, 靶序列分别

 

为: MYC₁ AACTATGACCTCGACTACGAC; MYC₂ AA-GAAATTCGAGCTGCTGCCC; M YC₃ AAGGCCCCCAAGG TAGTTATC; M YC₄ AAGCCACAGCATACATCCTGT。另设计一对对照 siRNA, 由武汉市晶赛生物技术有限公司合成。将 siRNA 经 BamHⅠ, H in dⅢ双酶切插入真核表达载体 pG enesi-l1 构建的质粒分别命名为: pG en-sil-c-myc-1、2、3、4和 pG ensil-c-myc-HK (对照质粒 )。

 

1.  4 阳离子聚合物 ( 梭华-Sofast^TM /DNA 试剂盒 ) 介导的细胞转染

 

细胞培养至 40% ~ 60% 汇合, 配制不同浓度的 pG ensil-c-myc-1、2、3、4(终质量浓度分别为 1、7. 5、10、

 

12.  5、15 ng /m l) 梭华-Sofast^TM  /DNA 复合物, 进行转染,

 

具体操作步骤见试剂盒说明书。

 

1.  5  集落形成实验

 

取以上各组转染细胞培养 48 h, 悬浮于 40e 预热

 

的  10%  FCS 的 DMEM 培养液中, 接种于 24 孔培养板,

 

吸取预热的 1. 2% 琼脂 125 Ll, 于 24 孔板中混匀。自然凝固后, 置 37e 、5% CO₂孵箱中培养 8~ 10 d, 取软琼脂层, 置于载玻片上, 镜下观察到细胞数在 50 个以上为一集落, 计算集落形成率。

 

1. 6  M TT 法检测细胞增殖

 

收集以上各组转染细胞, 用含 10% 小牛血清的培

 

养液配成单个细胞悬液, 调整细胞密度为 1. 0 @ 10⁵ /m l 接种到 96 孔板, 置 37e 、5% CO₂ 培养 4 h, 每孔加

 

M TT 溶液 ( 5 mg /m l) 20 Ll, 继续孵育 5 d, 终止培养, 弃孔内上清液。每孔加 100 LlDM SO, 振荡 10 m in, 使结晶充分溶解, 540 nm 检测各孔光密度值, 连续检测 5 d, 以时间为横坐标, 光密度值为纵坐标绘制生长曲线。

 

1. 7  逆转录反应

 

5 000 r/m in 离心 10m in, 收集各组转染细胞, 预冷

 

 

 

PBS洗涤 1 次后, 用 T rizo l一步法提取细胞总 RNA ,

 

取  1 Lg细胞总 RNA, 加入 O ligo prmi er ( 0. 5 Lg /Ll) 1 Ll, 去离子水 12 Ll混匀, 70 e 5 m in。 0 e 冰水浴立

 

刻终止,  5 000 r /m in 离心 4		s。加入 5 @ reaction buffer
4 Ll、R ibonuclease酶抑制剂 (		20 U /Ll) 1 Ll、dNTP s ( 10
Lm ol/) 2 Ll 混匀, 37 e	5	m in, 再加 R everse T ran-
scriptase ( 200 U /Ll)  1Ll,	42 e		60 m in, 再 70 e , 10
m in。 0 e 终止后, cDNA - 20 e			冻存。

 

1.  8  荧光定量检测 c-myc mRNA 的表达

 

采用 SYBR G reen荧光染料法针对 c-myc的 mRNA 进行实时 PCR 检测, 吸取逆转录反应产物 10 Ll引物上下游各 2 Ll, 缓冲液 10 Ll、ddH₂ O 4 Ll、ROX 荧光燃

 

料 1 L,l 预变性 95 e 10 m in、94 e 10 s, 56 e 30 s延伸 72 e 30 s, 35次循环, 72 e 5 m in。设置阴性对照

 

和   B-actin 内参照, 引物序列: F 5c-AGCTGCT-TAGACGCTGGATTT-3cR 5c-CGAGGTCAAGTTCCTGTT-GGT-3c

 

1. 9  W estern blotting定量检测 c-myc蛋白

 

转染细胞如 1. 4, 收集转染及正常的细胞, 细胞裂解液裂解, 取 20 Ll裂解样品液, 进行 SDS-PAGE 电泳, 表达产物电转移至硝酸纤维素膜上, 进行 W estern blotting反应, 通过 BandScan5. 0 软件对杂交图像进行分析, 以 B-actin 作为定量 M arker。

 

2   结 果

 

2. 1    siRNA 对 Colo320细胞转染效率的影响

 

阳离子聚合物与 pG ensil-c-myc-4 共转染, 60 m in 时转染效率达峰值, 峰值达 70% , 此后降低不显著, 240

 

m  in时被转染的细胞比率仍维持于 50% 。由于空白对照组不含荧光标记的转染物质, 故其转染效率为 0(图1)。同时发现 siRNA 的转染效率也随 siRNA 浓度的增加而升高, 增加到 15 ng /m l时转染效率最高。

 

2. 2  转染 siRNA 对细胞增殖的抑制

 

2. 2. 1  MTT 法检测转染细胞的生长曲线 由图 2 可

 

以看出, 转染了 pG ensil-c-myc-1、2、3、4 和 pG ensil-c-

 

myc-HK 各组的细胞较对照组细胞增殖缓慢, 第 3 天时抑制的效果最明显, 其中转染 pGensi-lc-m yc-4 的 Co lo320细胞抑制最显著。

 

2. 2. 2 集落形成实验观察转染细胞生长情况 通过集落形成试验观察细胞集落形成, 结果显示, 对照组细胞与 myc-HK 组细胞形成的集落直径大, 细胞饱满, 细胞间隙小, 细胞生长旺盛。而转染组细胞的细胞集落直径明显小于对照组, 细胞间隙大, 细胞增殖受到抑制, 其中转染 pG ensil-c-m yc-4组细胞变化尤为明显。实验结果表明转染 siRNA 可以抑制细胞的增殖 (图 3)。

黄浩,  等. 靶向 siRNA 对人直肠癌 Co lo320细胞的抑制作用                                          _{# 369#}

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图  1  荧光标记 pG ensi-l c-m yc-4在 Colo 320

 

细胞中的时相分布 ( @ 100)

 

F ig. 1   Chron-phase distribution of fluorescence labeling

 

pG ensi-l c-c-m yc-4	in Colo320 cells ( @ 100)
A:  B lank control siRNA	transfected;  B:  pG ensil-c-myc-4
transfected after 60 m in;	C:  pG ens i-l c-m yc-4 transfected

 

after 120 m in; D:  pG ensil-c-myc-4 transfected after 240 m in

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图  2 转染 siRNA对 Colo320细胞增殖的影响 F ig. 2 E ffects of siRNA transfection on cell Co lo320 proliferation

 

 

 

 

 

 

 

 

图  3  转染 pG ensi-l c-m yc-4对 Colo 320

 

细胞集落形态的影响 ( @ 100)

 

F ig. 3  E ffect of pG ensil-c-myc-4 transfection on m orphology of Colo 320 cell clone A: M orpho logy of Co lo 320 ce ll c lone;  B:  M orpho logy o f Colo 320 ce lls 24 h after transfected by pG ensil-c-m yc-4

 

2.  3  实时荧光定量 PCR 检测转染 siRNA 对 Co lo320

 

细胞 c-myc mRNA 的影响

 

Colo320 细胞转染 pG ensil-c-myc-1、2、3、4, 24 h后,

 

收集细胞抽提总 RNA, 应用荧光定量实时 RT-PCR 来

 

 

 

检测转染组与对照组 c-my c 的 mRNA 水平变化, 转染 pG ensil-c-myc-1、2、3、4 各组平均 CT 值为分别为 281 23、30. 12、32. 43、34. 65, 转染 pGensi-lc-m yc-HK 和对照细胞平均 CT 值为分别为 25. 31、26. 35(图 4)。结果表明转染了 pG ensil-c-myc-1、2、3、4 各组的 c-myc mRNA 表达水平比对照组明显降低, 4 个不同 siRNA 的抑制效果有差别, 转染 pG ensil-c-myc-4 抑制效率最高。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图  4 实时荧光定量 PCR检测各组转染细胞 c-myc mRNA的表达

 

F ig. 4   E xpression of c-m yc gene in each group

 

by real tim e fluorescent PCR

 

①:  B- actin; ②:  Control group; ③:  pG ens i-l c-m yc-HK

 

g roup; ④:  pG ensil-c-myc-1g roup;  ⑤:  pG ensil-c-

 

m yc-2 g roup; ⑥:  pG ensil-c-myc-3 group;

 

⑦ :  pG ens il-c-m yc-4 g roup; ⑧:  N egative group

 

2. 4 W estern blotting检测转染 siRNA 对 Co lo320 细胞c-myc蛋白影响的表达

 

由图 5 可知, 没有转染的正常 Colo320细胞和转染

 

了  pG enesil-c-myc-HK、pG ensil-c-m yc-1、2、3、4质粒 (各种质粒分别转染 12. 5 Lg /m l) 的 Colo320 细胞均可见

 

B-actin 略下方清晰杂交带, 将杂交带进行 Band-Scan510 软件分析, 以 B-action 为内参照定量 M arker, 得出结果分别为 11. 84、11. 32、1. 14、4143、1. 14、0. 51,

 

转染了 4种真核表达质粒的细胞表达的 c-myc蛋白量均显著降低, 其中转染 pGenesil-c-myc-4降低最显著。

 

3   讨 论

 

有关原癌基因与细胞周期调控的研究是近年来细胞生物学研究的热点之一, 取得了令人瞩目的成果。 c-my c是目前研究较多的原癌基因之一, 编码关键性调控蛋白, 在生理状态下不表达或仅限制性低表达, 参与调控正常细胞的增殖和分化; 在受到异常刺激激活后,其出现高表达, 导致细胞生长、分化凋亡等异常改变,与许多肿瘤的发生和发展有关 ^{[ 4-7]} 。

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